6º Fichamento. Questão 03 da Gincana de Genética

Avaliação de dois métodos de extração de DNA de material parafinado para amplificação em PCR.

SIMONATO LE, GARCIA JF, NUNES CM, MIYAHARA GI, J Bras Patol Med Lab, v.43, n.2, p. 121-127, abril 2007

"As técnicas de otimização de extração de DNA para utilização na reação em cadeia pela polimerase (PCR) permitem a investigação diagnóstica em diferentes amostras biológicas, mesmo quando o DNA está presente em pequenas quantidades. Resquícios de saliva, esfregaço bucal, sangue, bulbos capilares, tecidos incluídos em parafina, ossos, gotas de esperma, entre outros, podem fornecer informações importantes, desde que analisados de forma adequada. Segundo Kullmann , Lehmann e Kreipe e Liu, o fator que tem maior influência no sucesso da amplificação do DNA obtido de material parafinado é o grau de fragmentação do DNA presente. Neste trabalho apresentamos os resultados da extração de DNA de 35 amostras de tecido de casos de carcinoma epidermóide de assoalho bucal que haviam sido fixadas em formol a 10% e conservadas em blocos de parafina, empregando-se dois métodos de extração de DNA. Foram utilizadas 35 amostras de tecido provenientes de casos de carcinoma epidermóide de assoalho bucal. Antes da extração do DNA, os cortes passaram pelo processo de desparafinização. O protocolo para extração de DNA com Chelex 100® foi baseado no método descrito por Coombs . Em cada tubo foi adicionado 1 μl de proteinase K (20 mg/ml), sendo as amostras incubadas em banho-maria a 55°C, durante três horas, e agitadas gentilmente a cada hora. Após esse período, a cada tubo foram adicionados 100 μl de Chelex 100® a 5% (diluído em solução de Tris 10 mM e EDTA 1 mM), sendo os mesmos aquecidos a 99°C durante 10 minutos e agitados gentilmente após o término do aquecimento. Seguiu-se a centrifugação a 10.600 rpm durante 15 minutos. Os tubos foram novamente aquecidos a 45°C por cinco minutos e, posteriormente, foram adicionados 100 μl de clorofórmio. Realizou-se centrifugação a 10.600 rpm durante 15 minutos, recuperando-se o sobrenadante contendo o DNA em tubos limpos, que foram armazenados a 20°C negativos. O protocolo para extração de DNA a partir de material parafinado com o sistema comercial QIAamp DNA minikit® foi realizado de acordo com as normas do fabricante. Em cada tubo foram adicionados 180 μl de Buffer AT (Tissue Lysis Buffer), além de 20 μl de proteinase K. Após homogeneização, as amostras foram incubadas em banhomaria a 55°C, durante três horas, e agitadas gentilmente a cada hora. Após esse período, adicionaram-se a cada tubo 200 μl de Buffer AL (fornecido pelo fabricante), sendo os mesmos aquecidos a 70°C durante 10 minutos para a inativação da proteinase residual. Em seguida, foram adicionados 200 μl de etanol, agitando-se durante 15 segundos e centrifugando brevemente. A solução resultante foi transferida para o dispositivo da coluna QIAamp DNA minikit® e centrifugada a 8.000 rpm por um minuto. O dispositivo com a coluna foi removido do tubo e recolocado em um tubo limpo. Foram adicionados 500 μl de Buffer AW1 (Wash Buffer 1) ao dispositivo com a coluna, que foram centrifugados a 8.000 rpm por um minuto. O procedimento de lavagem foi repetido com 500 μl de Buffer AW2 (Wash Buffer 2), seguido de centrifugação a 14.000 rpm durante três minutos. O DNA extraído da coluna foi eluído pela adição de 100 μl de Buffer AE (fornecido pelo fabricante). Primeiramente foram adicionados 50 μl, aguardando-se um minuto e centrifugando-se a 8.000 rpm durante um minuto. Em seguida, 50 μl de Buffer AE foram adicionados, aguardando-se cinco minutos e centrifugando-se a 8.000 rpm por um minuto, após as amostras terem sido transferidas do dispositivo para tubo de recuperação. As mesmas foram armazenadas a -20°C. A análise estatística foi realizada por meio do teste t pareado, com nível de significância de 1%. A quantidade e a pureza do DNA genômico obtido por ambas as técnicas avaliadas foram satisfatórias para a realização da PCR. Houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos, tanto na quantidade (p = 0,0003) como na pureza (p < 0,0001) do DNA obtido. A fixação de tecidos com formol a 10% é um método prático e eficiente para sua preservação, sendo, portanto, largamente utilizado em anatomia patológica. Contudo esse tipo de fixação resulta no enovelamento de proteínas nucleares, na formação de ligações entre proteínas e DNA e na fragmentação do DNA, o que dificulta a extração dessa classe de moléculas de tecidos fixados. Os dois métodos utilizados para obtenção de DNA de material parafinado neste estudo apresentaram desempenho semelhante em condições locais, revelando que ambos os métodos descritos têm potencial para extrair DNA genômico de boa qualidade."