sábado, 4 de junho de 2011
Gincana de Genética Concluída!
Finalmente, concluí agora as questões da Gincana de Genética. Liberada da AV2 de Genética, não tem preço. Valeu à pena!
10º Fichamento. Questão 03 da Gincana de Genética
Terapia gênica
NARDI NB, TEIXEIRA L AK, SILVA E FA, Ciência & Saúde Coletiva, 7(1): 109-116, 2002
"A possibilidade de descrição genética do homem representa talvez o último nível de uma busca de autoconhecimento que teve início há milênios. O conhecimento dos genes responsáveis por características normais ou patológicas permite a plena aplicação dos princípios da medicina genômica, que deverá modificar os procedimentos médicos no diagnóstico e tratamento de várias doenças e onde se inclui a terapia gênica. Em doenças causadas por mutações gênicas, a introdução de um gene normal poderá reverter o quadro clínico."
"Apesar do acúmulo de conhecimento sobre a constituição genética do homem e as metodologias para a manipulação gênica, a aplicação da terapia gênica como uma rotina clínica tem esbarrado em diversos problemas de ordem técnica. Transferência gênica é um termo que inclui todos os procedimentos que visam à entrada de algum material genético em células-alvo. O material genético a ser utilizado em experimentos de transferência gênica é mais comumente encontrado em duas formas: na forma plasmidial, onde um gene de interesse é inserido em um plasmídio de expressão eucariota, promovendo assim a síntese da proteína desejada nas células ou tecidos alvos, ou na forma viral, onde o transgene substitui regiões gênicas de certos vírus. Os métodos de transferência gênica são geralmente divididos em três categorias: métodos físicos, métodos químicos e métodos biológicos."
"Tanto doenças hereditárias como adquiridas têm sido alvos constantes de estratégias de terapia gênica. "
"Apesar dos diversos protocolos clínicos aprovados para a transferência de genes em humanos, os benefícios reais alcançados até o momento com a terapia gênica são frustrantes e estão muito aquém das propostas iniciais. Os métodos de transferência gênica disponíveis, ainda que variados, são pouco eficientes e apresentam sérias limitações quanto ao direcionamento celular."
"Finalmente, deve ser lembrado que qualquer mal que possa resultar da pesquisa para a espécie humana não será causado por qualquer descoberta, mas sim da utilização que o homem fizer dela."
NARDI NB, TEIXEIRA L AK, SILVA E FA, Ciência & Saúde Coletiva, 7(1): 109-116, 2002
"A possibilidade de descrição genética do homem representa talvez o último nível de uma busca de autoconhecimento que teve início há milênios. O conhecimento dos genes responsáveis por características normais ou patológicas permite a plena aplicação dos princípios da medicina genômica, que deverá modificar os procedimentos médicos no diagnóstico e tratamento de várias doenças e onde se inclui a terapia gênica. Em doenças causadas por mutações gênicas, a introdução de um gene normal poderá reverter o quadro clínico."
"Apesar do acúmulo de conhecimento sobre a constituição genética do homem e as metodologias para a manipulação gênica, a aplicação da terapia gênica como uma rotina clínica tem esbarrado em diversos problemas de ordem técnica. Transferência gênica é um termo que inclui todos os procedimentos que visam à entrada de algum material genético em células-alvo. O material genético a ser utilizado em experimentos de transferência gênica é mais comumente encontrado em duas formas: na forma plasmidial, onde um gene de interesse é inserido em um plasmídio de expressão eucariota, promovendo assim a síntese da proteína desejada nas células ou tecidos alvos, ou na forma viral, onde o transgene substitui regiões gênicas de certos vírus. Os métodos de transferência gênica são geralmente divididos em três categorias: métodos físicos, métodos químicos e métodos biológicos."
"Tanto doenças hereditárias como adquiridas têm sido alvos constantes de estratégias de terapia gênica. "
"Apesar dos diversos protocolos clínicos aprovados para a transferência de genes em humanos, os benefícios reais alcançados até o momento com a terapia gênica são frustrantes e estão muito aquém das propostas iniciais. Os métodos de transferência gênica disponíveis, ainda que variados, são pouco eficientes e apresentam sérias limitações quanto ao direcionamento celular."
"Finalmente, deve ser lembrado que qualquer mal que possa resultar da pesquisa para a espécie humana não será causado por qualquer descoberta, mas sim da utilização que o homem fizer dela."
9º Fichamento. Questão 03 da Gincana de Genética
Mecanismos Patogênicos da Doença Periodontal Associada ao Diabetes Melito.
ALVES C, ANDION J, BRANDÃO M, MENEZES R, Arq Bras Endocrinol Metab 2007;51/7
"Diabetes Melito (DM) é uma doença crônica caracterizada por deficiência parcial ou total na produção de insulina ou por resistência à sua ação. Também está relacionado a complicações bucais. A doença periodontal (DP) é a complicação oral mais importante, sendo considerada a sexta complicação clássica do diabetes. Além do seu efeito deletério sobre a saúde oral e controle glicêmico, vários estudos têm demonstrado associação da doença periodontal com a doença coronariana, outra importante causa de morbidade e mortalidade em diabéticos."
"O dente pode ser dividido, de forma didática, em uma porção externa denominada coroa e outra interna embebida no processo alveolar, a raiz. O ligamento periodontal fixa o dente ao processo alveolar, sendo formado por tecido fibroso, células epiteliais e células mesenquimais indiferenciadas. A doença periodontal é o processo inflamatório que ocorre na gengiva em resposta a antígenos bacterianos da placa dentária que se acumulam ao longo da margem gengival. Diversos fatores associados ao DM podem influenciar a progressão e agressividade da doença periodontal: tipo de diabetes, idade do paciente, maior duração da doença e controle metabólico inadequado. A infecção periodontal, condicionada por células fagocitárias com monócitos pode induzir a um estado crônico de resistência à insulina, contribuindo para o ciclo de hiperglicemia. No DM, as principais alterações encontradas na saliva são hipossalivação e alteração da sua composição. O elevado teor de cálcio na saliva predispõe à formação de cálculo e fatores irritativos nos tecidos periodontais."
"Indivíduos com deficiente resposta imune não conseguem eliminar os microorganismos patogênicos, perpetuando o processo inflamatório. A inflamação crônica produz radicais livres de oxigênio que ativam metaloproteinases, que degradam o colágeno do ligamento periodontal diminuindo a fixação do dente ao processo alveolar e aumentando a profundidade do sulco gengival."
" Alterações genéticas podem aumentar a probabilidade de desenvolvimento do DM e doença periodontal.Em pacientes diabéticos, as alterações do tecido conjuntivo e vascular prejudicam a cicatrização dos tecidos normais, propiciando o desenvolvimento de doença periodontal."
"O diabetes melito está relacionado a diversas alterações que podem predispor à doença periodontal. Dentre elas, destacam-se as alterações bioquímicas, como produção de AGES, hiperglicemia intracelular gerando distúrbios nas vias do poliol, alterações na saliva, distúrbios imunológicos, como redução da função dos neutrófilos e aumento da produção de citocinas e mediadores inflamatórios, alterações genéticas que a probabilidade de desenvolvimento da doença periodontal e lesões teciduais, como comprometimento do metabolismo do colágeno, aumento da permeabilidade vascular e espessamento da membrana basal capilar. Os AGEs parecem ser um dos principais responsáveis pelas alterações que levam à doença periodontal, pois estão relacionados à diminuição da eficiência dos neutrófilos, aumento da destruição dos tecidos conjuntivo e ósseo, danos vasculares e produção exagerada de mediadores inflamatórios."
ALVES C, ANDION J, BRANDÃO M, MENEZES R, Arq Bras Endocrinol Metab 2007;51/7
"Diabetes Melito (DM) é uma doença crônica caracterizada por deficiência parcial ou total na produção de insulina ou por resistência à sua ação. Também está relacionado a complicações bucais. A doença periodontal (DP) é a complicação oral mais importante, sendo considerada a sexta complicação clássica do diabetes. Além do seu efeito deletério sobre a saúde oral e controle glicêmico, vários estudos têm demonstrado associação da doença periodontal com a doença coronariana, outra importante causa de morbidade e mortalidade em diabéticos."
"O dente pode ser dividido, de forma didática, em uma porção externa denominada coroa e outra interna embebida no processo alveolar, a raiz. O ligamento periodontal fixa o dente ao processo alveolar, sendo formado por tecido fibroso, células epiteliais e células mesenquimais indiferenciadas. A doença periodontal é o processo inflamatório que ocorre na gengiva em resposta a antígenos bacterianos da placa dentária que se acumulam ao longo da margem gengival. Diversos fatores associados ao DM podem influenciar a progressão e agressividade da doença periodontal: tipo de diabetes, idade do paciente, maior duração da doença e controle metabólico inadequado. A infecção periodontal, condicionada por células fagocitárias com monócitos pode induzir a um estado crônico de resistência à insulina, contribuindo para o ciclo de hiperglicemia. No DM, as principais alterações encontradas na saliva são hipossalivação e alteração da sua composição. O elevado teor de cálcio na saliva predispõe à formação de cálculo e fatores irritativos nos tecidos periodontais."
"Indivíduos com deficiente resposta imune não conseguem eliminar os microorganismos patogênicos, perpetuando o processo inflamatório. A inflamação crônica produz radicais livres de oxigênio que ativam metaloproteinases, que degradam o colágeno do ligamento periodontal diminuindo a fixação do dente ao processo alveolar e aumentando a profundidade do sulco gengival."
" Alterações genéticas podem aumentar a probabilidade de desenvolvimento do DM e doença periodontal.Em pacientes diabéticos, as alterações do tecido conjuntivo e vascular prejudicam a cicatrização dos tecidos normais, propiciando o desenvolvimento de doença periodontal."
"O diabetes melito está relacionado a diversas alterações que podem predispor à doença periodontal. Dentre elas, destacam-se as alterações bioquímicas, como produção de AGES, hiperglicemia intracelular gerando distúrbios nas vias do poliol, alterações na saliva, distúrbios imunológicos, como redução da função dos neutrófilos e aumento da produção de citocinas e mediadores inflamatórios, alterações genéticas que a probabilidade de desenvolvimento da doença periodontal e lesões teciduais, como comprometimento do metabolismo do colágeno, aumento da permeabilidade vascular e espessamento da membrana basal capilar. Os AGEs parecem ser um dos principais responsáveis pelas alterações que levam à doença periodontal, pois estão relacionados à diminuição da eficiência dos neutrófilos, aumento da destruição dos tecidos conjuntivo e ósseo, danos vasculares e produção exagerada de mediadores inflamatórios."
8º Fichamento. Questão 03 da Gincana de Genética.
Células-tronco em Odontologia
SOARES AP, KNOP L AH, JESUS AA, ARAÚJO TM, R Dental Press Ortodon Ortop Facial, Maringá, v.12, n.1, p. 33-40, jan./fev. 2007
"A perda dentária e dos tecidos periodontais pode resultar em movimento dos dentes remanescentes, dificuldade na mastigação, fonação, desequilíbrio na musculatura e comprometimento da estética dentária e do sorriso, comprometendo a auto-estima. esforços têm sido dirigidos para o desenvolvimento de mecanismos para a utilização de células-tronco na reposição de tecidos bucais. Para a bioengenharia é essencial uma tríade composta por células-tronco ou progenitoras, uma matriz que funcione como arcabouço e proteínas sinalizadoras, denominadas fatores de crescimento, como estímulo para diferenciação celular. Células-tronco são definidas como células indiferenciadas com grande capacidade de auto-renovação e de produzir pelo menos um tipo celular altamente especializado. Existem as embrionárias e as adultas.Inúmeros estudos têm isolado células altamente proliferativas, derivadas da polpa dentária. Constatou-se que tais células são multipotentes e possuem a capacidade de autorenovação e de diferenciação em diversos tipos celulares. Existem evidências de que células-tronco de dentes decíduos são similares àquelas encontradas no cordão umbilical. Para bioengenharia de tecidos, uma matriz é essencial, pois fornece o arcabouço necessário para o transporte de nutrientes, oxigênio e resíduos metabólicos."
"A morfogênese dentária envolve uma série de interações dinâmicas e recíprocas entre o ectoderma e o mesênquima. Inúmeros esforços têm sido direcionados para a regeneração periodontal. Laino et al.11 demonstraram a presença de células tronco-adultas no ligamento periodontal, com propriedade clonogênica e alta taxa proliferativa. O objetivo da Odontologia conservadora é restaurar ou regenerar os tecidos dentários para manter a vitalidade, a função e a estética do dente."
"Existe um grande avanço nos experimentos com células-tronco adultas provenientes de tecidos bucais. O seu fácil acesso e o fato de não serem órgãos vitais constituem um atrativo para testes de praticidade e viabilidade de técnicas da bioengenharia. É possível que, num futuro próximo, se utilize da bioengenharia na terapia endodôntica e periodontal, apesar de, atualmente, a ciência se encontrar distante de desenvolver órgãos dentários completos a partir de células-tronco, devido aos mecanismos complexos da formação dentária."
SOARES AP, KNOP L AH, JESUS AA, ARAÚJO TM, R Dental Press Ortodon Ortop Facial, Maringá, v.12, n.1, p. 33-40, jan./fev. 2007
"A perda dentária e dos tecidos periodontais pode resultar em movimento dos dentes remanescentes, dificuldade na mastigação, fonação, desequilíbrio na musculatura e comprometimento da estética dentária e do sorriso, comprometendo a auto-estima. esforços têm sido dirigidos para o desenvolvimento de mecanismos para a utilização de células-tronco na reposição de tecidos bucais. Para a bioengenharia é essencial uma tríade composta por células-tronco ou progenitoras, uma matriz que funcione como arcabouço e proteínas sinalizadoras, denominadas fatores de crescimento, como estímulo para diferenciação celular. Células-tronco são definidas como células indiferenciadas com grande capacidade de auto-renovação e de produzir pelo menos um tipo celular altamente especializado. Existem as embrionárias e as adultas.Inúmeros estudos têm isolado células altamente proliferativas, derivadas da polpa dentária. Constatou-se que tais células são multipotentes e possuem a capacidade de autorenovação e de diferenciação em diversos tipos celulares. Existem evidências de que células-tronco de dentes decíduos são similares àquelas encontradas no cordão umbilical. Para bioengenharia de tecidos, uma matriz é essencial, pois fornece o arcabouço necessário para o transporte de nutrientes, oxigênio e resíduos metabólicos."
"A morfogênese dentária envolve uma série de interações dinâmicas e recíprocas entre o ectoderma e o mesênquima. Inúmeros esforços têm sido direcionados para a regeneração periodontal. Laino et al.11 demonstraram a presença de células tronco-adultas no ligamento periodontal, com propriedade clonogênica e alta taxa proliferativa. O objetivo da Odontologia conservadora é restaurar ou regenerar os tecidos dentários para manter a vitalidade, a função e a estética do dente."
"Existe um grande avanço nos experimentos com células-tronco adultas provenientes de tecidos bucais. O seu fácil acesso e o fato de não serem órgãos vitais constituem um atrativo para testes de praticidade e viabilidade de técnicas da bioengenharia. É possível que, num futuro próximo, se utilize da bioengenharia na terapia endodôntica e periodontal, apesar de, atualmente, a ciência se encontrar distante de desenvolver órgãos dentários completos a partir de células-tronco, devido aos mecanismos complexos da formação dentária."
7º Fichamento. Questão 03 da Gincana de Genética
APLICAÇÕES DA BIOLOGIA MOLECULAR NA ODONTOLOGIA: CONCEITOS E TÉCNICAS
SILVA FB, SOUSA S MG, vol. 14 n.2 jul./dez. 2002
"Os avanços na biologia molecular têm contribuído significativamente para o entendimento da etiologia das doenças humanas, também vem apresentando aplicação bastante expressiva na pesquisa de marcadores genéticos úteis no diagnóstico laboratorial e na avaliação da predisposição a inúmeras doenças. Na área odontológica tem proporcionado o diagnóstico precoce da cárie dental, da doença periodontal e do câncer bucal."
"Os cromossomos são estruturas responsáveis pelo armazenamento, duplicação e transmissão de material genético. O ser humano possui 23 pares de cromossomos de tamanhos e formas diferentes. O DNA é um polímero formado por nucleotídeos. As bases nitrogenadas podem ser de dois tipos: pirimidínicas e púricas. Para o DNA ser comprimido dentro do núcleo celular, ele é helicoidizado em diversos níveis. O RNA é composto por uma única cadeia de nucleotídeos. Existem três tipos: mensageiro, ribossômico e transportador. A síntese de proteínas é ativada quando uma proteína torna-se necessária ao metabolismo celular. Para iniciar a síntese, a seqüência de DNA que contém o gene específico para determinada proteína deve estar com as pontes de hidrogênio rompidas entre as bases e a dupla hélice desenrolada. "
"A análise molecular é um novo método de avaliação que busca as alterações expressas em nível genético, ou seja, pelo DNA. Para extrair o DNA do núcleo celular, são necessárias várias etapas, que compreendem lise celular, extração das proteínas e do RNA, precipitação do DNA, até a purificação. A eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida é um método simples e rápido que separa o DNA em fragmentos de tamanhos diferentes usando enzimas de restrição. MÉTODOS: MÉTODO DE SOUTHERN - Depois de obtidos os fragmentos de DNA no gel, um certo segmento do DNA que contém o gene de interesse pode ser detectado pela hibridização com uma sonda específica. Para isso, o DNA contido no gel é transferido para um filtro de nitrocelulose ou náilon por meio do método de transferência chamado Southern blotting; HIBRIDIZAÇÃO COM OLIGONUCLEOTÍDEOS ALELOESPECÍFICOS - reconhecimento de um alelo particular usando-se diferentes sondas; REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE - amplificação enzimática específica do DNA visando à produção de milhões de cópias dessa seqüência em um tubo de ensaio. HIBRIDIZAÇÃO IN SITU DE FLUORESCÊNCIA - utiliza-se uma preparação de cromossomos metafásicos em lâmina, na qual o DNA cromossômico foi desnaturado pela exposição a formamida antes da hibridização, com uma sonda apropriada"
"A microbiologia bucal é essencial para a identificação e caracterização de vários microrganismos envolvidos nas infecções bucais. Muitos métodos têm sido usados na detecção da variação fenotípica e genotípica para a caracterização de patógenos periodontais, assim como na identificação de bactérias da cavidade bucal. Na terapia endodôntica, os profissionais serão capazes de desenvolver geneticamente tecido pulpar dentro do canal para crescer e preencher a câmara. Os genes supressores tumorais têm a propriedade de bloquear a proliferação celular descontrolada. Tem sido evidenciado que genes específicos estão alterados no câncer bucal. Acredita-se que o mapeamento do genoma e a clonagem de genes para síndromes de câncer fornecerão informações importantes a respeito dos mecanismos de carcinogênese e dos processos biológicos fundamentais. Atualmente, os patologistas têm dado maior importância à identificação da apoptose e da mitose para poderem melhor compreender a cinética e o desenvolvimento de diversos processos patológicos. Os carcinomas espinocelulares na cavidade bucal constituem a maior proporção de cânceres de cabeça e pescoço e umas das principais causas de morbidade e mortalidade mundial."
SILVA FB, SOUSA S MG, vol. 14 n.2 jul./dez. 2002
"Os avanços na biologia molecular têm contribuído significativamente para o entendimento da etiologia das doenças humanas, também vem apresentando aplicação bastante expressiva na pesquisa de marcadores genéticos úteis no diagnóstico laboratorial e na avaliação da predisposição a inúmeras doenças. Na área odontológica tem proporcionado o diagnóstico precoce da cárie dental, da doença periodontal e do câncer bucal."
"Os cromossomos são estruturas responsáveis pelo armazenamento, duplicação e transmissão de material genético. O ser humano possui 23 pares de cromossomos de tamanhos e formas diferentes. O DNA é um polímero formado por nucleotídeos. As bases nitrogenadas podem ser de dois tipos: pirimidínicas e púricas. Para o DNA ser comprimido dentro do núcleo celular, ele é helicoidizado em diversos níveis. O RNA é composto por uma única cadeia de nucleotídeos. Existem três tipos: mensageiro, ribossômico e transportador. A síntese de proteínas é ativada quando uma proteína torna-se necessária ao metabolismo celular. Para iniciar a síntese, a seqüência de DNA que contém o gene específico para determinada proteína deve estar com as pontes de hidrogênio rompidas entre as bases e a dupla hélice desenrolada. "
"A análise molecular é um novo método de avaliação que busca as alterações expressas em nível genético, ou seja, pelo DNA. Para extrair o DNA do núcleo celular, são necessárias várias etapas, que compreendem lise celular, extração das proteínas e do RNA, precipitação do DNA, até a purificação. A eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida é um método simples e rápido que separa o DNA em fragmentos de tamanhos diferentes usando enzimas de restrição. MÉTODOS: MÉTODO DE SOUTHERN - Depois de obtidos os fragmentos de DNA no gel, um certo segmento do DNA que contém o gene de interesse pode ser detectado pela hibridização com uma sonda específica. Para isso, o DNA contido no gel é transferido para um filtro de nitrocelulose ou náilon por meio do método de transferência chamado Southern blotting; HIBRIDIZAÇÃO COM OLIGONUCLEOTÍDEOS ALELOESPECÍFICOS - reconhecimento de um alelo particular usando-se diferentes sondas; REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE - amplificação enzimática específica do DNA visando à produção de milhões de cópias dessa seqüência em um tubo de ensaio. HIBRIDIZAÇÃO IN SITU DE FLUORESCÊNCIA - utiliza-se uma preparação de cromossomos metafásicos em lâmina, na qual o DNA cromossômico foi desnaturado pela exposição a formamida antes da hibridização, com uma sonda apropriada"
"A microbiologia bucal é essencial para a identificação e caracterização de vários microrganismos envolvidos nas infecções bucais. Muitos métodos têm sido usados na detecção da variação fenotípica e genotípica para a caracterização de patógenos periodontais, assim como na identificação de bactérias da cavidade bucal. Na terapia endodôntica, os profissionais serão capazes de desenvolver geneticamente tecido pulpar dentro do canal para crescer e preencher a câmara. Os genes supressores tumorais têm a propriedade de bloquear a proliferação celular descontrolada. Tem sido evidenciado que genes específicos estão alterados no câncer bucal. Acredita-se que o mapeamento do genoma e a clonagem de genes para síndromes de câncer fornecerão informações importantes a respeito dos mecanismos de carcinogênese e dos processos biológicos fundamentais. Atualmente, os patologistas têm dado maior importância à identificação da apoptose e da mitose para poderem melhor compreender a cinética e o desenvolvimento de diversos processos patológicos. Os carcinomas espinocelulares na cavidade bucal constituem a maior proporção de cânceres de cabeça e pescoço e umas das principais causas de morbidade e mortalidade mundial."
6º Fichamento. Questão 03 da Gincana de Genética
Avaliação de dois métodos de extração de DNA de material parafinado para amplificação em PCR.
SIMONATO LE, GARCIA JF, NUNES CM, MIYAHARA GI, J Bras Patol Med Lab, v.43, n.2, p. 121-127, abril 2007
"As técnicas de otimização de extração de DNA para utilização na reação em cadeia pela polimerase (PCR) permitem a investigação diagnóstica em diferentes amostras biológicas, mesmo quando o DNA está presente em pequenas quantidades. Resquícios de saliva, esfregaço bucal, sangue, bulbos capilares, tecidos incluídos em parafina, ossos, gotas de esperma, entre outros, podem fornecer informações importantes, desde que analisados de forma adequada. Segundo Kullmann , Lehmann e Kreipe e Liu, o fator que tem maior influência no sucesso da amplificação do DNA obtido de material parafinado é o grau de fragmentação do DNA presente. Neste trabalho apresentamos os resultados da extração de DNA de 35 amostras de tecido de casos de carcinoma epidermóide de assoalho bucal que haviam sido fixadas em formol a 10% e conservadas em blocos de parafina, empregando-se dois métodos de extração de DNA. Foram utilizadas 35 amostras de tecido provenientes de casos de carcinoma epidermóide de assoalho bucal. Antes da extração do DNA, os cortes passaram pelo processo de desparafinização. O protocolo para extração de DNA com Chelex 100® foi baseado no método descrito por Coombs . Em cada tubo foi adicionado 1 μl de proteinase K (20 mg/ml), sendo as amostras incubadas em banho-maria a 55°C, durante três horas, e agitadas gentilmente a cada hora. Após esse período, a cada tubo foram adicionados 100 μl de Chelex 100® a 5% (diluído em solução de Tris 10 mM e EDTA 1 mM), sendo os mesmos aquecidos a 99°C durante 10 minutos e agitados gentilmente após o término do aquecimento. Seguiu-se a centrifugação a 10.600 rpm durante 15 minutos. Os tubos foram novamente aquecidos a 45°C por cinco minutos e, posteriormente, foram adicionados 100 μl de clorofórmio. Realizou-se centrifugação a 10.600 rpm durante 15 minutos, recuperando-se o sobrenadante contendo o DNA em tubos limpos, que foram armazenados a 20°C negativos. O protocolo para extração de DNA a partir de material parafinado com o sistema comercial QIAamp DNA minikit® foi realizado de acordo com as normas do fabricante. Em cada tubo foram adicionados 180 μl de Buffer AT (Tissue Lysis Buffer), além de 20 μl de proteinase K. Após homogeneização, as amostras foram incubadas em banhomaria a 55°C, durante três horas, e agitadas gentilmente a cada hora. Após esse período, adicionaram-se a cada tubo 200 μl de Buffer AL (fornecido pelo fabricante), sendo os mesmos aquecidos a 70°C durante 10 minutos para a inativação da proteinase residual. Em seguida, foram adicionados 200 μl de etanol, agitando-se durante 15 segundos e centrifugando brevemente. A solução resultante foi transferida para o dispositivo da coluna QIAamp DNA minikit® e centrifugada a 8.000 rpm por um minuto. O dispositivo com a coluna foi removido do tubo e recolocado em um tubo limpo. Foram adicionados 500 μl de Buffer AW1 (Wash Buffer 1) ao dispositivo com a coluna, que foram centrifugados a 8.000 rpm por um minuto. O procedimento de lavagem foi repetido com 500 μl de Buffer AW2 (Wash Buffer 2), seguido de centrifugação a 14.000 rpm durante três minutos. O DNA extraído da coluna foi eluído pela adição de 100 μl de Buffer AE (fornecido pelo fabricante). Primeiramente foram adicionados 50 μl, aguardando-se um minuto e centrifugando-se a 8.000 rpm durante um minuto. Em seguida, 50 μl de Buffer AE foram adicionados, aguardando-se cinco minutos e centrifugando-se a 8.000 rpm por um minuto, após as amostras terem sido transferidas do dispositivo para tubo de recuperação. As mesmas foram armazenadas a -20°C. A análise estatística foi realizada por meio do teste t pareado, com nível de significância de 1%. A quantidade e a pureza do DNA genômico obtido por ambas as técnicas avaliadas foram satisfatórias para a realização da PCR. Houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos, tanto na quantidade (p = 0,0003) como na pureza (p < 0,0001) do DNA obtido. A fixação de tecidos com formol a 10% é um método prático e eficiente para sua preservação, sendo, portanto, largamente utilizado em anatomia patológica. Contudo esse tipo de fixação resulta no enovelamento de proteínas nucleares, na formação de ligações entre proteínas e DNA e na fragmentação do DNA, o que dificulta a extração dessa classe de moléculas de tecidos fixados. Os dois métodos utilizados para obtenção de DNA de material parafinado neste estudo apresentaram desempenho semelhante em condições locais, revelando que ambos os métodos descritos têm potencial para extrair DNA genômico de boa qualidade."
SIMONATO LE, GARCIA JF, NUNES CM, MIYAHARA GI, J Bras Patol Med Lab, v.43, n.2, p. 121-127, abril 2007
"As técnicas de otimização de extração de DNA para utilização na reação em cadeia pela polimerase (PCR) permitem a investigação diagnóstica em diferentes amostras biológicas, mesmo quando o DNA está presente em pequenas quantidades. Resquícios de saliva, esfregaço bucal, sangue, bulbos capilares, tecidos incluídos em parafina, ossos, gotas de esperma, entre outros, podem fornecer informações importantes, desde que analisados de forma adequada. Segundo Kullmann , Lehmann e Kreipe e Liu, o fator que tem maior influência no sucesso da amplificação do DNA obtido de material parafinado é o grau de fragmentação do DNA presente. Neste trabalho apresentamos os resultados da extração de DNA de 35 amostras de tecido de casos de carcinoma epidermóide de assoalho bucal que haviam sido fixadas em formol a 10% e conservadas em blocos de parafina, empregando-se dois métodos de extração de DNA. Foram utilizadas 35 amostras de tecido provenientes de casos de carcinoma epidermóide de assoalho bucal. Antes da extração do DNA, os cortes passaram pelo processo de desparafinização. O protocolo para extração de DNA com Chelex 100® foi baseado no método descrito por Coombs . Em cada tubo foi adicionado 1 μl de proteinase K (20 mg/ml), sendo as amostras incubadas em banho-maria a 55°C, durante três horas, e agitadas gentilmente a cada hora. Após esse período, a cada tubo foram adicionados 100 μl de Chelex 100® a 5% (diluído em solução de Tris 10 mM e EDTA 1 mM), sendo os mesmos aquecidos a 99°C durante 10 minutos e agitados gentilmente após o término do aquecimento. Seguiu-se a centrifugação a 10.600 rpm durante 15 minutos. Os tubos foram novamente aquecidos a 45°C por cinco minutos e, posteriormente, foram adicionados 100 μl de clorofórmio. Realizou-se centrifugação a 10.600 rpm durante 15 minutos, recuperando-se o sobrenadante contendo o DNA em tubos limpos, que foram armazenados a 20°C negativos. O protocolo para extração de DNA a partir de material parafinado com o sistema comercial QIAamp DNA minikit® foi realizado de acordo com as normas do fabricante. Em cada tubo foram adicionados 180 μl de Buffer AT (Tissue Lysis Buffer), além de 20 μl de proteinase K. Após homogeneização, as amostras foram incubadas em banhomaria a 55°C, durante três horas, e agitadas gentilmente a cada hora. Após esse período, adicionaram-se a cada tubo 200 μl de Buffer AL (fornecido pelo fabricante), sendo os mesmos aquecidos a 70°C durante 10 minutos para a inativação da proteinase residual. Em seguida, foram adicionados 200 μl de etanol, agitando-se durante 15 segundos e centrifugando brevemente. A solução resultante foi transferida para o dispositivo da coluna QIAamp DNA minikit® e centrifugada a 8.000 rpm por um minuto. O dispositivo com a coluna foi removido do tubo e recolocado em um tubo limpo. Foram adicionados 500 μl de Buffer AW1 (Wash Buffer 1) ao dispositivo com a coluna, que foram centrifugados a 8.000 rpm por um minuto. O procedimento de lavagem foi repetido com 500 μl de Buffer AW2 (Wash Buffer 2), seguido de centrifugação a 14.000 rpm durante três minutos. O DNA extraído da coluna foi eluído pela adição de 100 μl de Buffer AE (fornecido pelo fabricante). Primeiramente foram adicionados 50 μl, aguardando-se um minuto e centrifugando-se a 8.000 rpm durante um minuto. Em seguida, 50 μl de Buffer AE foram adicionados, aguardando-se cinco minutos e centrifugando-se a 8.000 rpm por um minuto, após as amostras terem sido transferidas do dispositivo para tubo de recuperação. As mesmas foram armazenadas a -20°C. A análise estatística foi realizada por meio do teste t pareado, com nível de significância de 1%. A quantidade e a pureza do DNA genômico obtido por ambas as técnicas avaliadas foram satisfatórias para a realização da PCR. Houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos, tanto na quantidade (p = 0,0003) como na pureza (p < 0,0001) do DNA obtido. A fixação de tecidos com formol a 10% é um método prático e eficiente para sua preservação, sendo, portanto, largamente utilizado em anatomia patológica. Contudo esse tipo de fixação resulta no enovelamento de proteínas nucleares, na formação de ligações entre proteínas e DNA e na fragmentação do DNA, o que dificulta a extração dessa classe de moléculas de tecidos fixados. Os dois métodos utilizados para obtenção de DNA de material parafinado neste estudo apresentaram desempenho semelhante em condições locais, revelando que ambos os métodos descritos têm potencial para extrair DNA genômico de boa qualidade."
5º Fichamento. Questão 03 da Gincana de Genética
Biologia molecular na odontologia: métodos comumente utilizados na cariologia;
VALARINI N, DOI RK, MACIEL SM, FREDERICO R CP, Odontol. Clín.-Cient., Recife, 10 (1) 19-23, jan./mar., 2011
"A cárie dentária é uma doença de caráter multifatorial e a interação de fatores do hospedeiro com microrganismos e dieta determinam sua manifestação. Estabelecer a base genética para esta doença fornecerá subsídios para o desenvolvimento de novas estratégias de prevenção, diagnóstico, tratamento, avaliação de risco e compreensão de sua patogênese. Diante do intenso desenvolvimento da Biologia Molecular, o presente trabalho tem como objetivo apresentar ao cirurgião-dentista esta promissora ciência e, principalmente, mostrar a aplicação da tecnologia em genética molecular na prevenção da cárie dentária. O início da era da Genética se deu em 1865, quando o monge Gregor Johann Mendel realizou experimentos de cruzamentos de ervilhas. Nascia, então, a Genética Clássica e os conceitos de gene, fenótipo, genótipo e transmissão de caracteres. O Projeto Genoma Humano (PGH) foi oficialmente iniciado em 1990, quando os Estados Unidos da América o lançaram como um programa com a finalidade de sequenciar o genoma humano. Com direção do NHI (National Institutes of Health) e do DOE (Departamento de Energia do Governo Americano), o projeto teve o envolvimento de 18 países, entre eles Inglaterra, Japão, Canadá, França, Brasil e Alemanha. O Brasil teve notável participação no estudo do genoma humano bem como de outras espécies. O principal agente causador da cárie dentária. Desde o início do século XX, pesquisadores já avaliavam a suscetibilidade genética à cárie dentária por meio de estudos com gêmeos monozigóticos e dizigóticos. Tais estudos indicavam que a herança genética tinha participação na cárie dentária, mas as conclusões eram de que esta herança era apenas um fator contribuinte. Quatro estudos detectaram um componente genético na suscetibilidade à cárie dentária e demonstraram que a cárie em gêmeos monozigóticos tinha uma concordância maior do que nos dizigóticos. O maior avanço no entendimento do papel da hereditariedade e a incidência da cárie dentária foi obtido com o estudo realizado intitulado "Minnesota Study of Twins Reared Apart". A maior vantagem do estudo foi a de que a maioria dos participantes tinha idade superior a quarenta anos e não vivia no mesmo ambiente logo após o nascimento até a data da análise. Foi sugerido que vários fatores genéticos podem estar envolvidos no processo da cárie dentária e na maior similaridade de cárie em gêmeos monozigóticos. Tais fatores são: salivares e da microbiota bucal, tempo e sequência de erupção dentária, morfologia dentária, forma do arco dentário, espaço dentário e propensão à dieta. Atualmente, existem muitos métodos para análise do DNA. As técnicas mais relevantes na área odontológica, com a finalidade de apresentar ao cirurgião-dentista as várias possibilidades existentes: Extração e purificação de ácidos nucleicos; Eletroforese; Reação em cadeia da polimerase; PCR em tempo real; Polimorfismos de tamanhos de fragmentos de restrição (RFLP); Amplificação Alelo Oligonucleotídeos- Específica (PCR-ASO); Reação em cadeia da polimerase utilizando primers arbitrários; Microarrays; Checkerboard DNA-DNA hybridization. A cárie dentária continua sendo uma doença muito prevalente na população mundial, mas que pode ser prevenida ou controlada. Os avanços na biologia molecular e nas tecnologias geradas nos últimos anos permitiram que novas abordagens acerca desta e de outras doenças bucais fossem utilizadas. Num futuro, dentistas serão capazes de aplicar técnicas de engenharia genética que estimulem a reparação do próprio corpo."
VALARINI N, DOI RK, MACIEL SM, FREDERICO R CP, Odontol. Clín.-Cient., Recife, 10 (1) 19-23, jan./mar., 2011
"A cárie dentária é uma doença de caráter multifatorial e a interação de fatores do hospedeiro com microrganismos e dieta determinam sua manifestação. Estabelecer a base genética para esta doença fornecerá subsídios para o desenvolvimento de novas estratégias de prevenção, diagnóstico, tratamento, avaliação de risco e compreensão de sua patogênese. Diante do intenso desenvolvimento da Biologia Molecular, o presente trabalho tem como objetivo apresentar ao cirurgião-dentista esta promissora ciência e, principalmente, mostrar a aplicação da tecnologia em genética molecular na prevenção da cárie dentária. O início da era da Genética se deu em 1865, quando o monge Gregor Johann Mendel realizou experimentos de cruzamentos de ervilhas. Nascia, então, a Genética Clássica e os conceitos de gene, fenótipo, genótipo e transmissão de caracteres. O Projeto Genoma Humano (PGH) foi oficialmente iniciado em 1990, quando os Estados Unidos da América o lançaram como um programa com a finalidade de sequenciar o genoma humano. Com direção do NHI (National Institutes of Health) e do DOE (Departamento de Energia do Governo Americano), o projeto teve o envolvimento de 18 países, entre eles Inglaterra, Japão, Canadá, França, Brasil e Alemanha. O Brasil teve notável participação no estudo do genoma humano bem como de outras espécies. O principal agente causador da cárie dentária. Desde o início do século XX, pesquisadores já avaliavam a suscetibilidade genética à cárie dentária por meio de estudos com gêmeos monozigóticos e dizigóticos. Tais estudos indicavam que a herança genética tinha participação na cárie dentária, mas as conclusões eram de que esta herança era apenas um fator contribuinte. Quatro estudos detectaram um componente genético na suscetibilidade à cárie dentária e demonstraram que a cárie em gêmeos monozigóticos tinha uma concordância maior do que nos dizigóticos. O maior avanço no entendimento do papel da hereditariedade e a incidência da cárie dentária foi obtido com o estudo realizado intitulado "Minnesota Study of Twins Reared Apart". A maior vantagem do estudo foi a de que a maioria dos participantes tinha idade superior a quarenta anos e não vivia no mesmo ambiente logo após o nascimento até a data da análise. Foi sugerido que vários fatores genéticos podem estar envolvidos no processo da cárie dentária e na maior similaridade de cárie em gêmeos monozigóticos. Tais fatores são: salivares e da microbiota bucal, tempo e sequência de erupção dentária, morfologia dentária, forma do arco dentário, espaço dentário e propensão à dieta. Atualmente, existem muitos métodos para análise do DNA. As técnicas mais relevantes na área odontológica, com a finalidade de apresentar ao cirurgião-dentista as várias possibilidades existentes: Extração e purificação de ácidos nucleicos; Eletroforese; Reação em cadeia da polimerase; PCR em tempo real; Polimorfismos de tamanhos de fragmentos de restrição (RFLP); Amplificação Alelo Oligonucleotídeos- Específica (PCR-ASO); Reação em cadeia da polimerase utilizando primers arbitrários; Microarrays; Checkerboard DNA-DNA hybridization. A cárie dentária continua sendo uma doença muito prevalente na população mundial, mas que pode ser prevenida ou controlada. Os avanços na biologia molecular e nas tecnologias geradas nos últimos anos permitiram que novas abordagens acerca desta e de outras doenças bucais fossem utilizadas. Num futuro, dentistas serão capazes de aplicar técnicas de engenharia genética que estimulem a reparação do próprio corpo."
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